Статья поступила в редакцию 14.01.2020 г.
УДК 567.8
© 2020 г. Книсс В.А.*, Морозова И.М.**, Морозов М.К.**
*Институт экологической экспертизы и биоинформационных технологий.
Респ. Башкортостан, Уфимский район, 450571, д. Юматово, ул. Парковая, д. 36.
**Башкирское отделение Московского общества испытателей природы.
Респ. Башкортостан, Уфимский район, 450571, д. Юматово, ул. Парковая, д. 36.
// Материалы по флоре и фауне Республики Башкортостан. 2020. № 26. С. 20-28.
Влияние выделяемых лягушками содержащихся в кожной слизи веществ на деятельность молочнокислых бактерий заметили ещё в древности. Однако более детально изучать эту проблему начали лишь с середины 1970-х годов.
В настоящее время в научно-исследовательских лабораториях многих стран ведутся разработки лекарственных средств на основе выделяемых амфибиями соединений-пептидов как аналога антибиотиков, позволяющих бороться с бактериями, вирусами и грибками (Nascimento et al., 2003). В частности, результаты таких исследований показали, что антимикробные пептиды настоящих лягушек полезны, прежде всего, как вещества, активно подавляющие различные инфекции (Ponti et al., 2003). На сегодняшний день известна противораковая, иммуномодулирующая и антимикробная активность таких пептидов. Кроме того, экзометаболиты могут использоваться и в фармацевтике, прежде всего, за счёт своей избирательности по отношению к разнообразным патогенам. Вполне возможно использовать их в сельскохозяйственном производстве и пищевой промышленности.
Так, в 2016 г. Т.Х. Тимохиной с соавторами в Тюменском медицинском университете было впервые проведено комплексное изучение влияния состава корневых экзометаболитов пшеницы на рост, колонизацию и антигрибковую активность ризобактерий в условиях, моделирующих ризосферу отдельных растений. Установлено, что наибольшей бактерицидной активностью в отношении тест-штамма золотистого стафилококка St. aureus обладали двухсуточные экзометаболиты. При этом была отмечена массовая гибель St. aureus через 30 мин. экспозиции совместно с экзометаболитами бактерии B. bifidum (Тимохина, 2016). Результаты данной работы можно использовать и для более результативного применения ризобактерий, стимулирующих рост растений (PGPR – plant growth promoting rhizobacteria) в сельскохозяйственной практике. С целью повышения эффективности ассоциативного симбиоза PGPR с другими (не бобовыми) растениями, с одной стороны, при селекции бактерий целесообразно учитывать их способность утилизировать основные компоненты корневых выделений, которая может определять уровень ассоциативности бактерий с растением. С другой стороны, соотношение органических кислот к сахарам в корневых выделениях является признаком, по которому можно вести селекцию растений.
Результаты эксперимента, проведённого В.А. Валуевым (2013) показывают, что полученный им раствор экзометаболитов, разбавленный в 10 тыс. раз оживляюще действует на подвергнутые слабому отравлению зёрна пшеницы. И хотя в дальнейшем его действие на эту культуру становится таким же, как и у обычной воды, данное свойство такого сильно разбавленного раствора может найти применение в сельском хозяйстве, когда стоит вопрос о быстром проращивании корневой системы у протравленных зёрен, внесённых в грунт. Автор эксперимента отметил, что, во-первых, обработка протравленного зерна должна проходить непосредственно перед посевом и, во-вторых, не рекомендуется использовать раствор 1:1000 в дальнейшем при поливе, т.к. он подавляет развитие проростков.
По-видимому, в некоторых случаях сильноразбавленные растворы экзометаболитов способны конкурировать с искусственными препаратами типа «Байтан».
Влияние экзометаболитов на позвоночных животных на примере лягушки травяной изучено В.С. Геворкян (2012) Установлено, что растущие личинки (головастики) лягушки выделяют в воду экзометаболиты, подавляющие развитие более мелких особей. Автор также отметил, что экзометаболиты, достигнув в воде определённой концентрации, становятся опасными не только для мелких головастиков, но и для крупных, лидирующих в развитии, особей. Таким образом, находясь в малом объеме воды, головастики отравляют друг друга выделяемыми экзометаболитами. Отдельно (Валуев и др, 2016) исследовано влияние выделяемых озерной лягушкой Rana ridibunda пептидов на развитие корневой системы и побегов ячменя Hordeum vulgare, которые проращивали, используя растворы экзометаболитов пяти разных концентраций: от 0,01 до 100 %; контролем служила отстоявшаяся водопроводная вода. Выяснилось, что выделяемые лягушкой в состоянии покоя в зимний (неактивный) период, биологически активные вещества угнетающе воздействуют на зерно ячменя, понижая его всхожесть, развитие корневой системы и рост побегов. Однако, при увеличении светового дня и температуры окружающей среды — полученный метаболит при действии в разных концентрациях наоборот, начинает влиять на развитие ячменя уже как стимулятор.
В то же время выявлено отсутствие прямой связи между концентрацией экзометаболитов и их влиянием на растение: наиболее активно и положительно на развитие корневой системы и побегов ячменя влияет разбавленная в 10 тысяч раз исходная жидкость (Валуев и др., 2016).
Методика приготовления растворов весеннего и осеннего экзометаболитов
Пять взрослых остромордых лягушек 25 мая (весенний экзометаболит) и 5 сентября (осенний экзометаболит) были помещены в глубокий таз, с пятью литрами воды из родника. Ёмкость держали вне помещения; средняя температура окружающей среды днем: +20оС, ночью: +17оС. По истечении 5 суток из ёмкости с амфибиями взяли 1 литр жидкости, которую приняли за 100% раствор. Затем приготовили 3 раствора разной концентрации в следующей последовательности: – контроль (родниковая вода); 1:10; 1:30; 1:100. Соответствующие промеры производились по методу морфофизиологической оценки проростков, утвержденному Государственной семенной инспекцией МСХ СССР от 31.12. 1982 г.
Для эксперимента брали по 120 семян редиса сорта «Французский завтрак» с последующей закладкой на 4 полосы влажной ткани шириной 15 см, и подложкой из изолона. На ткани по заранее проведенной линии на расстоянии 2 см размещали семена зародышами вниз для удобства последующей оценки состояния проростков. Полученные 4 полосы изолона и ткани с семенами свертывали в неплотные рулоны, которые, затем, поместили в сосуды с растворами соответствующей концентрации (покрывает около 5 см нижней части рулона). Ёмкости помещали в затемнённое место на 6 суток, и в дальнейшем содержали при постоянной температуре около 20оС. Ежедневно раствор доливался до необходимого уровня. После окончания срока проращивания рулоны разворачивали, фотографировали и приступали к оценке проростков путём соответствующих промеров.
Оценка роста и развития проростков редиса была проведена нами на 4 и 6 сутки, при этом учитывались темпы роста (всхожести), количество листьев, суммарная длина стеблей, суммарная длина главного корня и боковых корешков.
Темп роста (всхожесть) рассчитывался по следующей формуле:
А=(В/С) х100%, где А – темп роста; В – число нормально развитых проростков; С – общее количество взятых для анализа семян.
Статистическая обработка полученных результатов была проведена нами на основе программы Exel 2007.
Оценка влияния различных концентраций экзометаболита
на рост и развитие проростков редиса
Через 4 суток (96 часов) всхожесть (темп роста) семян в контроле, растворах 1:10, и 1:30 была наименьшей – 30-35 мм. В то же время максимальная всхожесть (60-70 мм) наблюдалась в растворе 1:100 (весна, осень) табл. 1.
По количеству зеленых листьев в контроле (вода), растворах 1:30 и 1:10 – от 0 до 2 листьев; в 1:100 (весна, осень) 5 и 6 листьев соответственно (табл.1).
Следует отметить, что суммарная длина главного корня во всех растворах резко отличалась в сравнении с контрольным показателем. Она нарастает по мере уменьшения концентрации экзометаболита в растворах: от 105 до 249 мм в растворе 1:100 (весна) при значении 46 мм в контроле.
Сравнительный анализ результатов замера суммарной длины стеблей в каждой из групп проростков редиса показал, что они были отмечены лишь в растворе 1:100 (осень), 45 мм (табл.1).
Таблица 1
Параметры проростков семян редиса через 96 часов (4 суток)
Показатели
|
Концентрация
|
контроль
|
1:10
|
1:30
|
1:100 (весна)
|
1:100 (осень)
|
Темп всхожести (%)
|
35
|
30
|
35
|
60
|
70
|
Число семядоль-ных листьев
|
0
|
2
|
0
|
5
|
6
|
Суммарная длина главного корня, мм
|
46
|
105
|
153
|
249
|
187
|
Суммарная длина стеблей, мм
|
0
|
0
|
0
|
0
|
45
|
Аналогичные данные представлены на рис. 1, 2.
![](http://ecobioexpert.ru/wp-content/uploads/2020/03/1.png)
Рис.1. Параметры развития редиса через 96 часов.
Таким образом, наиболее значимым параметром развития и роста семян редиса является именно нарастание корневой системы. Чем обширнее корневая система и, соответственно, площадь питания растения, тем интенсивнее будет его рост (рис. 2).
![](http://ecobioexpert.ru/wp-content/uploads/2020/03/2.png)
Рис.2. Параметры развития корней проростков редиса через 96 часов.
Из таблицы № 2 видно, что через 144 часа темп всхожести семян был наиболее низким в растворе метаболита 1:10 (на 5% ниже, чем в контроле). В то же время в растворе 1:30 аналогичные показатели на 10% выше контроля. Максимальные же значения влияния экзометаболита (56% выше контроля) чётко проявились как в весенних, так и осенних растворах 1:100.
Данные по количеству зеленых листьев: в контроле и 1:10 – по 5 штук, значительно большее их число отмечено во всех остальных растворах, независимо от времени получения последних (табл. 2).
Суммарная длина главного корня, формирующегося у проростков, также значительно отличается от таковых контроля (88 мм); и нарастает с уменьшением концентрации экзометаболита в растворах: от 130 мм в 1:30 до 350 мм в растворе 1:100 (осень).
Суммарная длина боковых (прилежащих) корешков во всех растворах также резко отличается от контроля; максимальная – 143 мм, в растворе 1:30, в растворах: 1:100 (74-77 мм) и в растворе 1:10 – 46 мм при значении в контроле (вода) всего 7 мм (табл. 2).
Таблица 2
Параметры развития редиса через 144 часа (6 суток)
Показатели
|
Концентрация
|
Кон-троль
|
1:10
|
1:30
|
1:100 весна
|
1:100 осень
|
Темпы всхожести
|
45
|
40
|
55
|
70
|
70
|
Число семядольных листьев, шт.
|
5
|
5
|
10
|
10
|
9
|
Общая длина боко-вых корешков, мм
|
7
|
46
|
143
|
77
|
74
|
Общая длина главного корня, мм
|
88
|
130
|
303
|
342
|
350
|
Общая длина стеблей, мм
|
78
|
105
|
258
|
291
|
255
|
Отдельно следует отметить такой показатель, как длина стеблей. Так, наиболее низкие значения выявлены в контроле (78 мм), а наибольшие – в растворе 1:100 (291 мм, весна). Аналогично высокие показатели отмечены в растворах 1:30 (258 мм), 1:100 (255мм, осень) и 1:10 (105 мм).
Обобщённые результаты эксперимента представлены на рисунках 3, 4.
![](http://ecobioexpert.ru/wp-content/uploads/2020/03/3.png)
Рис. 3. Параметры развития редиса через 144 часа.
![](http://ecobioexpert.ru/wp-content/uploads/2020/03/4.png)
Рис.4. Параметры развития корней редиса через 144 часа.
Таким образом, экспериментально установлено положительное воздействие растворов экзометаболитов остромордой лягушки на рост и развитие проростков редиса, что позволяет сделать предварительный прогноз об аналогичном влиянии данного действующего вещества и на другие растения. Наиболее значимым фактором действия экзометаболита, стимулирующим развитие проростков является интенсивное формирование корневой системы, что необходимо растениям для устойчивого развития в период недостатка влаги.
Выявлены оптимальные показатели влияния экзометаболитов (1:100) для роста и развития проростков редиса как в весенних, так и осенних растворах, что свидетельствует об аналогичном его действии на проростки, независимо от периода активности остромордой лягушки.
Прослеживается закономерность: чем ниже концентрация раствора, тем выше положительный эффект.
Литература
Валуев В.А. Влияние экзометаболитов озёрной лягушки Rana ridibunda на обработанное 0,1% хлором зерно пшеницы // Сборник научных трудов SWorld. Материалы международной научно-практической конференции “Научные исследования и их практическое применение. Современное состояние и пути развития ‘2013”. Одесса: КУПРИЕНКО. Цит: 113-0449. Т. 38. № 1. С.38-40.
Валуев В.А. Загорская В.В., Книсс В.А., Назаров В.С., Хабибуллин В.Ф. Влияние экзометаболитов озёрной лягушки Rana ridibunda L. на развитие ячменя Hordeum vulgare (Pall.) // Экология урбанизированных территорий. 2016. № 4. С.6-11.
Геворкян В.С. Воздействие экзометаболитов на позвоночных на примере лягушки травяной Rana temporaria // Электронное научное издание Альманах Пространство и Время. 2012. Т. 1. № 1. Специальный выпуск «Система планета Земля».
Кравченко Л.В. Роль корневых экзометаболитов в интеграции микроорганизмов с растениями. Автореферат дисс. на соискание уч. степени доктора биол. наук. – Санкт-Петербург. 2000. 435 с.
Тимохина Т.Х., Марков А.А., Паромова Я.И., Самикаева В.Н., Перунова Н.Б. Способ получения экзометаболитов бифидобактерий с высокой антимикробной активностью //Медицинская наука и образованиеУрала//, Т.17, № 2 (86) Изд-во: Тюменский государственный медицинский университет (Тюмень), 2016 г. – С.152-154.
Nascimento A.C.C., Fontes W., Sebben, A., Castro M.S. Antimicrobial peptides from anurans skin secretions // Protein and Peptide Letters. 2003. 10 (3). P. 227-238.
Ponti, D., Mangoni M. L., Mignogna G., Simmaco M., Barra, D. An amphibian antimicrobial peptide variant expressed in Nicotiana tabacum confers resistance to phytopathogens // Bioch. J. 2003. Vol. 370 (1). P. 121-127.