Разрушение органического вещества в водоемах с участием ферментов, выделяемых в среду микроорганизмами

Садчиков А.П.

Международный биотехнологический центр МГУ им. М.В.Ломоносова

119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, стр. 12

Е-mail: aquaecotox@yandex.ru

// Материалы по флоре и фауне Республики Башкортостан. 2017. № 17. С. 61-67.

   Гетеротрофная активность водных организмов являются основой при изучении очистительной способности водоемов, трансформации органического вещества по трофической цепи и др. Чтобы в какой-то мере понять  механизм такого явления были проведены эксперименты по изучению ферментативной активности (на примере протеолитической) водорослей и бактерий в природных водоемах и лабораторных экспериментах.

Материал и методика исследований

   Протеолитическую активность определяли методом, основанным на измерении поляризации флуоресценции меченого флуоресцентным красителем флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) белка-иммуноглобулина G (IgG-ФИТЦ) под воздействием ферментов-протеаз, выделяемых в среду микроорганизмами (Савицкий,  1990; Садчиков А.П., Френкель О.А., Дмитровский Л.Г.,  Еремин С.А., 1993). Этот метод обладает высокой чувствительностью и позволяет определять  экзопротеазную активность всего за несколько минут без концентрирования пробы. Он широко применяется при изучении кинетики ферментативных процессов, фармакологии, биохимии и др. (Бекбергенов, Житников, 1988; Савицкий 1990; Юденфренд, 1965).

   Схема проведения  эксперимента по изучению протеолитической активности имеет следующий вид. В анализируемую пробу (в воду из водоема или лабораторной культуры организмов) добавляют трассер (меченый флуоресцентным красителем белок) и анализируют степень его деградации под действием присутствующих в воде ферментов. Интенсивность броуновского движения молекул зависит, в частности, от размера молекул. Если молекула содержит флуоресцентную метку, то поляризация флуоресценции служит мерой броуновского движения и дает информацию о размерах макромолекул. Под действием ферментов происходит их гидролиз, а это, в свою очередь, сказывается на величине молекулы, а соответственно и поляризации флуоресценции. Таким образом, по величине поляризации флуоресценции судят об относительном изменении размеров макромолекул в процессе ферментативной реакции (Дмитровский, Садчиков, 1994).

   В качестве метки используется флуоресцентный краситель – флуоресцеин. Последний при возбуждении испускает флуоресцентный свет, степень поляризации которого зависит от скорости его вращения. Метка в свободном состоянии вращается быстро; между периодом поглощения и испускания света молекула равновероятно принимает любую ориентацию, что приводит к полной деполяризации сигнала. Т.е. в водном растворе поляризация флуоресцеина приближается к нулю. Если же метка связана с крупными молекулами (в частности, с белками), то в течение периода флуоресценции его вращение  замедляется, и величина поляризации возрастает. Таким образом, чем крупнее молекула, тем выше величина поляризации. Под действием ферментов происходит гидролиз пептидных связей в молекуле белка, в результате чего размеры молекул уменьшаются и это сказывается на величине поляризации флуоресценции.

   Регистрация поляризации флуоресценции осуществляется на специальном приборе (TDX – анализатор фирмы ABBOTT Laboratories, США), который позволяет измерять поляризацию флуоресценции, а микропроцессор выдает распечатку результатов с учетом калибровочных кривых. Время, необходимое для  получения окончательных результатов, составляет 5 минут. Прибор позволяет одновременно анализировать до 20 проб объемом 1 мл.

   В исследованиях в качестве субстрата использовали иммуноглобулин человека (IgG) меченый флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). В эксперименте (к примеру, в сообщество водорослей и бактерий) добавляли  IgG-ФИТЦ (концентрация 1,25 мкг/мл), который при наличии фермента-протеазы гидролизовался. Пробы с IgG-ФИТЦ инкубировали в течение 3 ч (анализ проводили каждый час).

Таким образом, в ходе эксперимента измерялась величина поляризации флуоресценции IgG-ФИТЦ в процессе его деградации под действием протеаз. В качестве контроля использовали стерильный буфер (не содержащий протеаз), чтобы иметь исходный уровень отсчета флуоресценции молекул IgG-ФИТЦ.

Описанным выше методом можно изучать скорость протеолитической реакции, как в культурах, так и в природных водоемах.

   Гетеротрофную активность бактерий и водорослей определяли по включению в клетку аминокислоты (14С-глутаминовой кислоты), белка (3Н- иммуноглобулина G). В склянки  с водорослями и бактериями  добавляли 14С-глутаминовую кислоту (около 100 тыс. им. мин/мл), 3Н- иммуноглобулин G (около 20 тыс. им. мин/мл), и экспонировали в течение одного  часа. Затем содержимое склянки фильтровали через мембранные фильтры  (водоросли – размер пор 1,5 мкм, бактерии – 0,2 мкм) и подсчитывали их радиоактивность  на сцинтилляционном счетчике «Rackbeta 1217» (фирма LKB).

Опыты проводили с альгологически чистыми культурами  зеленых водорослей Scenedesmus quadricauda, Chlorella vulgaris, цианобактерии Spirulina sp.  и бактерий Bacillus subtilis. Наличие бактерий определяли непосредственно под микроскопом. Для этого 1 мл пробы фильтровали через мембранные фильтры с порами 0,2 мкм, окрашивали акридиновым оранжевым и подсчитывали число клеток под микроскопом.

   Кроме того, в опытах использовали аксеничные (безбактериальные) культуры Anabaena variabilis (цианобактерия), зеленые водоросли Chlorella vulgaris, Scenedesmus quadricauda, Chlamydomonas gyrus.

 Результаты исследований

   Исследования в пруду, расположенном на территории ботанического сада МГУ, показали, что фито-и бактериопланктон потребляет как аминокислоту (14С-глутаминовую кислоту), так и белок (3Н- иммуноглобулина G), причем количество включенной в клетку метки чаще всего зависело от интенсивности развития этих организмов, и в первую очередь бактерий. Меченый белок наиболее активно  включался в клетки бактерий и водорослей при отмирании фитопланктона в конце июня и в начале августа. Поступление в среду органических веществ при отмирании водорослей стимулировало гетеротрофную активность фито-и бактериопланктона. При интенсивном развитии водорослей в июле потребление органических веществ было минимальным.

   Общая картина потребления белка водорослями и бактериями была сходной, различие заключалось лишь временной сдвинутости этих процессов. Бактерии как бы быстрее реагировали на отмирании фитопланктона, чем водоросли. В среднем за сезон на долю бактерий приходилось 65% потребленного микроорганизмами меченого альбумина (на долю водорослей – соответственно – 35%). Что касается потребления меченой аминокислоты, то на долю водорослей приходилось 44% от общего ее потребления фито-и бактериопланктоном. В отдельные периоды сезона водоросли потребляли ее значительно больше, чем бактерии. Полученные результаты свидетельствуют, что фитопланктон потребляет аминокислоты наравне с бактериями, тогда как белок в большей степени утилизируется бактериями.

   Известно, через клеточную стенку микроорганизмов проникают лишь низкомолекулярные соединения. Поэтому высокомолекулярные соединения должны быть предварительно гидролизованы экзоферментами. В гетерогенных системах (почвах, илах, на поверхности детрита и др.) выделенный в среду фермент локализован в непосредственной близости от клетки, а продукты гидролиза сразу же потребляются этими организмами. В толще воды (в гомогенной системе) наблюдается иная картина; ферменты, выделенные в среду поступают в общую копилку РОВ водоема. Продукты гидролиза потребляются всей биотой независимо от того, могут они (или наоборот не могут) экскретировать в среду литические ферменты. Скорость потребления РОВ во многом зависит от их физиологических возможностей организмов, концентрации РОВ в среде, многих биотических и абиотических факторов.

   Выделенные в толщу воды ферменты гидролизуют  органическое вещество, а продукты гидролиза потребляются всеми присутствующими организмами (в первую очередь бактериями и водорослями).  Несмотря на неодинаковую способность организмов экскретировать  в среду литические ферменты, многие из них (а это бактерии, водоросли, грибы, простейшие, и даже некоторые многоклеточные) способны потреблять низкомолекулярные соединения, что и было показано многими исследователями. А скорость потребления РОВ организмами во многом зависит от их физиологических возможностей, концентрации органического вещества в среде, ряда биотических и абиотических факторов.

Потребление органического вещества бактериям и водорослями вызывает резонный вопрос о способности этих групп микроорганизмов выделять в среду экзоферменты и взаимосвязи этих процессов с их гетеротрофной активностью. Чтобы ответить на некоторые из этих вопросов, и был проведен ряд экспериментов с природным фито-и бактериопланктоном и лабораторными культурами водорослей и бактерий.

   В работе анализировали потребление водорослями и бактериями низко- и высокомолекулярных соединений (на примере аминокислоты и белка) с одновременным анализом в среде протеолитической активности с использованием метода поляризации флуоресценции.

Исследования с природным сообществом фито-и бактериопланктона показали, что в воде присутствуют протеазы, которые гидролизуют белок до его составляющих (аминокислот). Последние в дальнейшем потребляются как водорослями, так и бактериями.

Ферментативные процессы протекают, как в присутствии природного сообщества фито- и бактериопланктона, одних только бактерий (после отфильтровывания водорослей) и «чистой» воде (после отфильтровывания бактерий).

   Способность «чистой» воды к ферментативному гидролизу белка указывает на наличие экзопротеаз в свободном состоянии. На долю этого фильтрата (т.е. «чистой» воды) приходилось две трети от ферментативной активности природного сообщества фито- и бактериопланктона. Показатели ферментативной активности воды с одними только бактериями практически совпадали с аналогичными показателями воды с фито- и бактериопланктоном. Пики гетеротрофной и ферментативной активности фито-и бактериопланктона  совпадали, что опять же подчеркивает взаимосвязь этих процессов.

Это показывает, что организмы выделяют в среду литические ферменты (в частности, протеазы), которые функционируют вне связи с организмами – их продуцентами. Это в дальнейшем позволяет потреблять продукты гидролиза всем комплексом присутствующих гидробионтов.

   Эти эксперименты не могут показать, кто из сообщества фито- и бактериопланктона выделяют в среду протеазы. Для этого были проведены эксперименты с водорослями и бактериями, отдельно.

Аналогичное наблюдали в альгологически чистых культурах Scenedesmus quadricauda, Chlorella vulgaris, Spirulina sp. и бактерии Bacillus subtilis. На долю «чистой» культуральной жидкости B. subtilis приходилось 69% протеолитической активности среды, в которой находились эти бактерии. У водорослей (Spirulina sp., S.quadricauda, Ch. vulgaris) аналогичные показатели составляли соответственно 94%, 75% и 50%. Наличие ферментов в свободном состоянии дает возможность утилизировать продукты гидролиза субстрата всеми присутствующими организмами, как бактериями, так и водорослями.

   Так как в альгологически чистых культурах водорослей находились бактерии (а их численность была в пределах 1-5 млн. кл/мл), в этих опытах трудно установить источник продуцирования экзоферментов. Это могли быть, как бактерии, так и водоросли, тем более что результаты ферментативной активности водорослей совместно с бактериями было выше, чем одних только бактерий (после отфильтровывания водорослей). Складывается впечатление, что водоросли вносят свою долю экзоферментов в их общее количество. Однако если учесть, что при отфильтровывании водорослей возможно частичное удаление бактерий (особенно конгломератов, детритно-бактериальных ассоциаций), то, возможно, это и приводит к заниженным результатам  ферментативной активности бактерий.

  Далее возникает вопрос, а выделяют ли экзоферменты сами водоросли? Эксперименты с аксеничными (т.е. безбактериальными) культурами Anabaena variabilis, Chlorella vulgaris, Scenedesmus quadricauda, Chlamydomonas gyrus показали, что эти водоросли и цианобактерии хорошо потребляют меченую аминокислоту (14С-глутаминовую кислоту), а высокомолекулярное соединение – белок  (3Н- имууноглобулина G) – ими не включался в клетки. Кроме того,  ферментативная активность среды с водорослями не обнаруживалась (при использовании метода поляризации флуоресценции). Некоторые водоросли культивировали три недели и в течение всего этого времени  фототрофы потребляли только меченую аминокислоту; потребление ими белка не происходило, а протеолитическая активность в среде не обнаруживалась.

  В отличие от водорослей, Bacillus subtilis хорошо потреблял как меченые аминокислоты, так  и меченый белок. Протеолитическая активность в среде B.subtilis постоянно регистрировалась.

Добавление фильтрата Bacillus subtilis в культуру бактериально чистых культур Anabaena variabilis и Scenedesmus quadricauda приводило к увеличению гетеротрофной активности этих водорослей: у S.quadricauda – она возрастала в 2 раза, а у A. variabilis – в 7 раз. В бактериальном фильтрате содержатся ферменты (протеазы), которые гидролизуют имеющийся в среде белок, что способствует повышению гетеротрофной активности водорослей.

         Все это указывает на неспособность водорослей экскретировать в среду протеазы, а возможно, и другие литические ферменты. Проведенные эксперименты показывают, что основная роль в ферментативном гидролизе органического вещества принадлежит бактериям. Водоросли потребляют низкомолекулярные продукты, которые были гидролизованы ферментами бактерий. Способность «чистой» воды к ферментативному гидролизу РОВ указывает на наличие ферментов в свободном состоянии. Это дает возможность утилизировать продукты гидролиза пищевого субстрата всеми присутствующими организмами, а скорость потребления органического вещества зависит уже от физиологических возможностей самих гидробионтов.

 

Литература

 Бекбергенов Б.М., Житников В.Г. Иммуноанализ на основе прямого измерения поляризации флуоресценции при изучении фармакокинетики антибиотиков. // Антибиотики и химиотерапия. 1988, т. 33. № 1, с. 72-76.

Дмитровский Л.Г., Садчиков А.П. Стимуляция протеолитической активности бактерий некоторыми водорослями. // Гидробиологический журнал, 1994, т. 30, № 1, с. 53-59.

Савицкий А.П. Флуоресцентный анализ: иммуноанализ, гибридные ДНК, биосенсоры. // Успехи биологической химии, 1990, т. 31, с. 209-240.

Садчиков А.П., Френкель О.А., Скобеева  Т.Н. Ферментативная и гетеротрофная активность водорослей и бактерий. // Гидробиологический журнал, 1992, т. 28, № 6, с. 51-55.

Садчиков А.П., Френкель О.А., Дмитровский Л.Г.,  Еремин С.А. Ферментативная и гетеротрофная активность водорослей и бактерий при потреблении меченых аминокислот, дипептида и белков. // Гидробиологический журнал, 1993, т. 29, № 3, с. 71-76.

Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в химии и медицине. // М.: Мир,, 1965, 484 с.